從1977年第一代DNA測序技術(shù)（Sanger法）1，發(fā)展至今三十多年時(shí)間，測序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展，從第一代到第三代乃至第四代，測序讀長從長到短，再從短到長。雖然就當(dāng)前形勢看來第二代短讀長測序技術(shù)在全球測序市場上仍然占有著絕對的優(yōu)勢位置，但第三和第四代測序技術(shù)也已在這一兩年的時(shí)間中快速發(fā)展著。測序技術(shù)的每一次變革，也都對基因組研究，疾病醫(yī)療研究，藥物研發(fā)，育種等領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推動作用。在這里我主要對當(dāng)前的測序技術(shù)以及它們的測序原理做一個(gè)簡單的小結(jié)。

　　圖1：測序技術(shù)的發(fā)展歷程

　　生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學(xué)的研究有著十分重要的意義。以上（圖1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個(gè)測序技術(shù)的發(fā)展歷程。

　　第一代測序技術(shù)

　　第一代DNA測序技術(shù)用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創(chuàng)的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學(xué)法（鏈降解）。并在1977年，桑格測定了第一個(gè)基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個(gè)堿基1。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力，并以此為開端步入基因組學(xué)時(shí)代。研究人員在Sanger法的多年實(shí)踐之中不斷對其進(jìn)行改進(jìn)。在2001年，完成的首個(gè)人類基因組圖譜就是以改進(jìn)了的Sanger法為其測序基礎(chǔ)，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列（圖2）。這個(gè)網(wǎng)址為sanger測序法制作了一個(gè)小短片，形象而生動。

　　值得注意的是，就在測序技術(shù)起步發(fā)展的這一時(shí)期中，除了Sanger法之外還出現(xiàn)了一些其他的測序技術(shù)，如焦磷酸測序法、鏈接酶法等。其中，焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術(shù)所使用的測序方法2–4，而連接酶測序法是后來ABI公司SOLID技術(shù)使用的測序方法2,4，但他們的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中斷DNA合成反應(yīng)的dNTP。

　　圖2：Sanger法測序原理

　　第二代測序技術(shù)

　　總的說來，第一代測序技術(shù)的主要特點(diǎn)是測序讀長可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，但其測序成本高，通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。因而第一代測序技術(shù)并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技術(shù)誕生了。第二代測序技術(shù)大大降低了測序成本的同時(shí)，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，以前完成一個(gè)人類基因組的測序需要3年時(shí)間，而使用二代測序技術(shù)則僅僅需要1周，但在序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)則要短很多。表1和圖3對第一代和第二代測序技術(shù)各自的特點(diǎn)以及測序成本作了一個(gè)簡單的比較5，以下我將對這三種主要的第二代測序技術(shù)的主要原理和特點(diǎn)作一個(gè)簡單的介紹。

　　圖3. 測序成本的變化

　　1.Illumina

　　Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測序機(jī)器，這兩個(gè)系列的技術(shù)核心原理是相同的2,4。這兩個(gè)系列的機(jī)器采用的都是邊合成邊測序的方法，它的測序過程主要分為以下4步，如圖4.

　　（1）DNA待測文庫構(gòu)建

　　利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫。

　　（2）Flowcell

　　Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道，當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時(shí)候會隨機(jī)附著在flowcell表面的channel上。每個(gè)Flowcell有8個(gè)channel，每個(gè)channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增。

　　（3）橋式PCR擴(kuò)增與變性

　　橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴(kuò)增，如圖4.a所示。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán)，最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個(gè)束都含有單個(gè)DNA模板的很多分拷貝，進(jìn)行這一過程的目的在于實(shí)現(xiàn)將堿基的信號強(qiáng)度放大，以達(dá)到測序所需的信號要求。

　　（4）測序

　　測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測序法）。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護(hù)，因而每次只能添加一個(gè)dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護(hù)基團(tuán)，以便能進(jìn)行下一輪的測序反應(yīng)。Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題，它的主要測序錯(cuò)誤來源是堿基的替換，目前它的測序錯(cuò)誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序?yàn)槔?0x測序深度大約為1周。

　　圖4.Illumina測序流程

　　1.Roche 454

　　Roche 454測序系統(tǒng)是第一個(gè)商業(yè)化運(yùn)營二代測序技術(shù)的平臺。它的主要測序原理是（圖5 abc）2：

　　（1）DNA文庫制備

　　454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫（圖5a）。

　　（2）Emulsion PCR（乳液PCR，其實(shí)是一個(gè)注水到油的獨(dú)特過程）

　　454當(dāng)然DNA擴(kuò)增過程也和illumina的截然不同，它將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。

　　乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”（水包油），基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)磁珠。

　　這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結(jié)合在磁珠上。同時(shí)孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，所以保證了每個(gè)與磁珠結(jié)合的小片段都能獨(dú)立進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反應(yīng)完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來。進(jìn)過擴(kuò)增，每個(gè)小片段都將被擴(kuò)增約100萬倍，從而達(dá)到下一步測序所要求的DNA量。

　　（3）焦磷酸測序

　　測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個(gè)小孔僅能容納一個(gè)磁珠，通過這種方法來固定每個(gè)磁珠的位置，以便檢測接下來的測序反應(yīng)過程。

　　測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測序反應(yīng)。測序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果。由于每一種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來判斷被測分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測序反應(yīng)進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。由于454測序技術(shù)中，每個(gè)測序反應(yīng)都在PTP板上獨(dú)立的小孔中進(jìn)行，因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于其能獲得較長的測序讀長，當(dāng)前454技術(shù)的平均讀長可達(dá)400bp，并且454技術(shù)和illumina的Solexa和Hiseq技術(shù)不同，它最主要的一個(gè)缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測量同聚物的長度，如當(dāng)序列中存在類似于PolyA的情況時(shí)，測序反應(yīng)會一次加入多個(gè)T，而所加入的T的個(gè)數(shù)只能通過熒光強(qiáng)度推測獲得，這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯(cuò)誤。

　　圖5.Roche 454測序流程

　　1.Solid技術(shù)

　　Solid測序技術(shù)是ABI公司于2007年開始投入用于商業(yè)測序應(yīng)用的儀器。它基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過程之中測序（圖6）2,4。它的原理是：

　　圖6-a.Solid測序技術(shù)

　　（1）DNA文庫構(gòu)建

　　片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。

　　（2）Emulsion PCR

　　Solid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um。在擴(kuò)增的同時(shí)對擴(kuò)增產(chǎn)物的3’端進(jìn)行修飾，這是為下一步的測序過程作的準(zhǔn)備。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測序區(qū)域（圖6-a）。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。

　　（3）連接酶測序

　　這一步是Solid測序的獨(dú)特之處。它并沒有采用以前測序時(shí)所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3’-XXnnnzzz-5’。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5’末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個(gè)8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測序法，兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號，相當(dāng)于一次能決定兩個(gè)堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時(shí)，就會發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號后，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割，這樣就能移除熒光信號，以便進(jìn)行下一個(gè)位置的測序。不過值得注意的是，通過這種測序方法，每次測序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在測到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n-1進(jìn)行第二輪測序。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個(gè)堿基（圖6-a. 8）。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測序位置往3’端移動一個(gè)堿基位置，因而就能測定第0、1位和第5、6位……第二輪測序完成，依此類推，直至第五輪測序，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個(gè)位置的堿基均被檢測了兩次。該技術(shù)的讀長在2×50bp，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次檢測，這一技術(shù)的原始測序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%，而15x覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確性更是達(dá)到了99.999%，應(yīng)該說是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個(gè)熒光信號，因而一旦發(fā)生錯(cuò)誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯(cuò)誤。

　　圖6-b.Solid測序技術(shù)

　　第三代測序技術(shù)

　　測序技術(shù)在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術(shù)，被稱之為第三代測序技術(shù)。與前兩代相比，他們最大的特點(diǎn)就是單分子測序，測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　其中PacBio SMRT技術(shù)其實(shí)也應(yīng)用了邊合成邊測序的思想5，并以SMRT芯片為測序載體。基本原理是：DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記4種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。同時(shí)這個(gè)DNA聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會輻射到周圍，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理）,從而可起保護(hù)作用。同理,在一個(gè)反應(yīng)管(SMRTCell:單分子實(shí)時(shí)反應(yīng)孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導(dǎo)孔),外徑 100多納米,比檢測激光波長小(數(shù)百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū),能量被限制在一個(gè)小范圍(體積20X 10-21 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個(gè)小反應(yīng)區(qū)域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實(shí)現(xiàn)將背景降到最低。另外，可以通過檢測相鄰兩個(gè)堿基之間的測序時(shí)間，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時(shí)的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個(gè)來之間檢測甲基化等信息（圖7）。SMRT技術(shù)的測序速度很快，每秒約10個(gè)dNTP。但是，同時(shí)其測序錯(cuò)誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通?。?，達(dá)到15%,但好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯(cuò)誤的偏向，因而可以通過多次測序來進(jìn)行有效的糾錯(cuò)。

　　圖7.PacBio SMRT測序原理

　　Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同，它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)5。該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，他們設(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時(shí)，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基（圖8）。

　　該公司在去年基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(AGBT)上推出第一款商業(yè)化的納米孔測序儀，引起了科學(xué)界的極大關(guān)注。納米孔測序（和其他第三代測序技術(shù)）有望解決目前測序平臺的不足，納米孔測序的主要特點(diǎn)是：讀長很長，大約在幾十kb，甚至100 kb;錯(cuò)誤率目前介于1%至4%，且是隨機(jī)錯(cuò)誤，而不是聚集在讀取的兩端;數(shù)據(jù)可實(shí)時(shí)讀取;通量很高(30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成);起始DNA在測序過程中不被破壞;以及樣品制備簡單又便宜。理論上，它也能直接測序RNA。

　　納米孔單分子測序計(jì)算還有另一大特點(diǎn)，它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像傳統(tǒng)方法那樣對基因組進(jìn)行bisulfite處理。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)現(xiàn)象有極大的幫助。并且改方法的測序準(zhǔn)確性可達(dá)99.8%，而且一旦發(fā)現(xiàn)測序錯(cuò)誤也能較容易地進(jìn)行糾正。但目前似乎還沒有應(yīng)用該技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。

　　圖8. 納米孔測序

　　其他測序技術(shù)

　　目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測序技術(shù)——Ion Torrent6。該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，一個(gè)小孔就是一個(gè)測序反應(yīng)池。當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時(shí)，會釋放出一個(gè)氫離子，反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號，H+離子信號再直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，從而讀出DNA序列（圖9）。這一技術(shù)的發(fā)明人同時(shí)也是454測序技術(shù)的發(fā)明人之一——Jonathan Rothberg，它的文庫和樣本制備跟454技術(shù)很像，甚至可以說就是454的翻版，只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測H+信號的變化來獲得序列堿基信息。Ion Torrent相比于其他測序技術(shù)來說，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此，成本相對來說會低，體積也會比較小，同時(shí)操作也要更為簡單，速度也相當(dāng)快速，除了2天文庫制作時(shí)間，整個(gè)上機(jī)測序可在2-3.5小時(shí)內(nèi)完成，不過整個(gè)芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗(yàn)證的測序。

　　圖9.Ion Torrent

　　小結(jié)

　　以上，對各代測序技術(shù)的原理做了簡要的闡述，這三代測序技術(shù)的特點(diǎn)比較匯總在以下表1和表2中。其中測序成本，讀長和通量是評估該測序技術(shù)先進(jìn)與否的三個(gè)重要指標(biāo)。第一代和第二代測序技術(shù)除了通量和成本上的差異之外，其測序核心原理（除Solid是邊連接邊測序之外）都是基于邊合成邊測序的思想。第二代測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是成本較之一代大大下降，通量大大提升，但缺點(diǎn)是所引入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯(cuò)誤率，并且具有系統(tǒng)偏向性，同時(shí)讀長也比較短。第三代測序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點(diǎn)而開發(fā)的，它的根本特點(diǎn)是單分子測序，不需要任何PCR的過程，這是為了能有效避免因PCR偏向性而導(dǎo)致的系統(tǒng)錯(cuò)誤，同時(shí)提高讀長，并要保持二代技術(shù)的高通量，低成本的優(yōu)點(diǎn)。

　　表1：測序技術(shù)的比較

　　表2：主流測序機(jī)器的成本測序比較

　　以下圖10展示了當(dāng)前全球測序儀的分布情況。圖中的幾個(gè)熱點(diǎn)區(qū)主要分布在中國的深圳（主要是華大），南歐，西歐和美國。